實(shí)驗(yàn)第一步，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)！不同的實(shí)驗(yàn)方法需要設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)分組也是不一樣噠，常見的幾種分組簡(jiǎn)單整理如下哦~
通常情況下，每組實(shí)驗(yàn)至少需要設(shè)置 3-5 個(gè)平行，減少實(shí)驗(yàn)誤差。注意：以上是常規(guī)的分組思路，一些特殊實(shí)驗(yàn)方法可能需要設(shè)置更多的分組 (如 LDH 細(xì)胞活力檢測(cè))，實(shí)驗(yàn)開始前詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書或?qū)嶒?yàn) Protocol 是一個(gè)好習(xí)慣哦！
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)好了，要開始實(shí)驗(yàn)了，檢查一下我們的試劑/儀器準(zhǔn)備好了嗎？
細(xì)胞系、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素，有條件的小伙伴也可以直接購買完全培養(yǎng)基哦~96 孔板、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑、無菌槍頭、無菌離心管、無菌水、無菌 PBS、酶標(biāo)儀等。
一切準(zhǔn)備就緒，我們來進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇吧~
【細(xì)胞復(fù)蘇】
取一支凍存細(xì)胞，在 37℃ 水浴中快速解凍。迅速轉(zhuǎn)移至 10 mL 完全培養(yǎng)基中，800 rpm 3 min 常溫離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，并置于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(更多細(xì)胞復(fù)蘇 tips，請(qǐng)參考往期推文：干貨分享 | 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇避坑指南)注意: 不同凍存液細(xì)胞復(fù)蘇可能有差異，還是那句話，實(shí)驗(yàn)開始前要詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書或?qū)嶒?yàn) Protocol！ 找一個(gè)合適的時(shí)間，看看我們的細(xì)胞是不是乖乖長(zhǎng)大了？ 嗯~長(zhǎng)得還不錯(cuò) 
，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來判斷一下最佳接種細(xì)胞量以及試劑使用量吧~
【對(duì)數(shù)期細(xì)胞收集】
細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)收集細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
【調(diào)整細(xì)胞密度】
使用 96 孔板時(shí)每孔加入 100 μL 細(xì)胞混懸液，設(shè)置 5-7 個(gè)細(xì)胞密度梯度，每個(gè)細(xì)胞密度設(shè)置 3-5 個(gè)復(fù)孔，確定檢測(cè)試劑所需最佳細(xì)胞密度
啥都準(zhǔn)備好了，廢話不說，我們上實(shí)驗(yàn)！
【正式實(shí)驗(yàn)】：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接種細(xì)胞，置于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
【配制藥物母液】：按照需要的實(shí)驗(yàn)藥物濃度合理配制藥物母液，使用時(shí)稀釋母液即可。
【加藥】：每孔加入相同體積不同濃度的藥物，設(shè)置藥物處理時(shí)間為 12 h、24 h、36 h、48 h 等。
【檢測(cè)】：藥物處理后選擇合適的方法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。
基于 WST-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色檢測(cè)法，主要用于細(xì)胞活性檢測(cè)。檢測(cè)原理： WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成 Formazan (橙黃色)。CCK-8 為預(yù)混溶液，即開即用。
具體操作如下：
1） 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；
2） 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-4 h (避免放在培養(yǎng)箱邊緣位置)；
3） 酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。
▐ 2. Cell-ATP 檢測(cè)
也叫做 CTG 檢測(cè)，基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過對(duì) ATP 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。檢測(cè)原理：熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O2 為底物，在 Mg2+ 存在時(shí)，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。此方法不受化合物自發(fā)熒光的影響。
具體操作如下：
1) 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡 10 min;
2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 檢測(cè)試劑;
3) 室溫振蕩混勻 2 min，以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解;
4) 室溫孵育 10 min (可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整孵育時(shí)間)，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定;
5) 使用具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定 (檢測(cè)參數(shù)可根據(jù)儀器類型及檢測(cè)靈敏度適當(dāng)調(diào)整)。
▐ 3. LDH 檢測(cè)
乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 檢測(cè)試劑盒可以在細(xì)胞膜完整性喪失進(jìn)而細(xì)胞漿內(nèi)酶釋放時(shí)檢測(cè)細(xì)胞損傷。檢測(cè)原理：在 LDH 的作用下，乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脫氫酶催化反應(yīng)生成 NAD+ 和 Formazan。此方法與 CCK-8 聯(lián)用可以用于死、活細(xì)胞的同步檢測(cè)。
注意：此方法需要設(shè)置高對(duì)照組，即在培養(yǎng)基中加入10 μL Lysis Solution。
1) 藥物處理細(xì)胞后，從 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；
2) 室溫避光孵育 30 min；
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度。
1) 96 孔板每孔吸棄 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，每孔加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；
2) 室溫避光孵育 30 min；
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度。
在細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，常見的數(shù)據(jù)分析方法是分析藥物處理前后 OD 值的變化，小 M 也為您整理了幾種方法~
細(xì)胞接種時(shí)需要注意 96 孔板外圈不宜做實(shí)驗(yàn)用途，可以用無菌水填滿，避免培養(yǎng)導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)。▐ 2. 對(duì)數(shù)期細(xì)胞怎么確定？每種細(xì)胞的倍增時(shí)間不一樣，在養(yǎng)細(xì)胞初期，可以做細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線來確認(rèn)細(xì)胞的倍增時(shí)間，根據(jù)細(xì)胞倍增時(shí)間推測(cè)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間。也可以在細(xì)胞匯合度達(dá)到 80% 左右時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行接種。▐ 3. 接種細(xì)胞數(shù)量怎么確定？接種的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)藥物培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞翻倍速度來確定接種數(shù)量。▐ 4. 每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？1）當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基或無菌水，不作為測(cè)定孔用。
2）有可能會(huì)因?yàn)?CCK-8 掛壁而產(chǎn)生誤差，建議在加入 CCK-8 后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
3）每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少，請(qǐng)預(yù)先在 1,000～100,000 個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。
▐ 5. 哪些物質(zhì)會(huì)影響 CCK-8 的測(cè)定？當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響 CCK-8 的測(cè)定 (含有維生素 C 的 Glucose 等)。一般培養(yǎng)基中的酚紅或血清不影響測(cè)定。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測(cè)定結(jié)果，扣除空白吸收即可。▐ 6. 在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2 h 縮短為 1 h。▐ 7. CCK-8 對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入 CCK-8 培養(yǎng) 1-4 h 吸光度已經(jīng)很高，但懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長(zhǎng)孵育時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。▐ 8. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。▐ 9. CCK-8 能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測(cè) E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。具體操作：向 100 μL E.coli 培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 h 或過夜，再進(jìn)行吸光度測(cè)定。
